Mørk feltmikroskopi
Den mørke feltmikroskopi er en velkendt i over 250 års variant af lysmikroskopi . Det fører til en mørk baggrund, mod hvilken de strukturer, der skal observeres, skiller sig ud. Som et resultat kan der stadig genereres velopløste billeder med høj kontrast af transparente objekter med kun meget lav kontrast , uden at præparatet skal farves på forhånd. Levende objekter kan også let observeres. Indtil udviklingen af fasekontrastmikroskopi i 1930'erne var mørkfeltmikroskopi den eneste metode til kontrastforbedring i ufarvede prøver . I modsætning til mørkfeltmikroskopi kaldes teknologien "normal" lysmikroskopiKaldes brightfield mikroskopi .
Princippet om mørkt feltmikroskopi er baseret på det faktum, at genstande ikke kun absorberer lys , men også altid afbøjer en del af lysstrålen. Hvis belysningen er indstillet således, at de direkte lysstråler passerer mikroskop linse , beskueren ser kun den afrettet lys. En af årsagerne til distraktion er spredning af lys på små partikler, kendt som Tyndall -effekten , som også kan observeres, for eksempel når lys falder ind i et mørkt rum, og støvet i lysstrålen er tydeligt synligt. Partikler, der er mindre end mikroskopets opløsningsgrænse , afbøjer også lys og kan derfor detekteres med et mørkt feltmikroskop. Nogle egenskaber, såsom partiklers mobilitet, kan undersøges på denne måde. Denne applikation var vigtigere end ultramikroskopi i begyndelsen af det 20. århundrede .
Prøven kan belyses bagfra prøven set fra objektet (transmitteret lys) eller fra objektivsiden (indfaldende lys) eller også fra siden, som det er tilfældet med slids -ultralydsmikroskopet . Transmitteret lys og reflekteret lys mørke felter er mulige både i "normale" mikroskoper og i stereomikroskoper .
Sammenligning af brightfield og darkfield
Lys og mørkt felt med transmitteret lysbelysning
Ved mikroskopi er transmitteret lysbelysning et arrangement, hvor belysningen sker fra bagsiden af prøven set fra målet, lyset passerer gennem prøven ( transmission ) og til sidst når målet. Normal transmitteret lysmikroskopi, mere præcist: transmitteret lys lyst feltmikroskopi, er den variant, der oftest bruges i biologi og medicin, den bruges også i skolemikroskoper.
I klassisk lysfeltmikroskopi med transmitteret lys skabes billedkontrasten hovedsageligt af, at prøven absorberer en del af det indfaldende lys, og det tilsvarende område ser mørkere ud (se figur 1). Mange mikroskopiske objekter er imidlertid stort set gennemsigtige eller meget små og absorberer derfor kun meget lidt lys. De genererer kun en lav kontrast i lysfeltmikroskopet og er derfor vanskelige at se på den lyse baggrund (se figur 2 til venstre). Sådanne genstande kan aflede lys, dvs. ændre retningen af nogle lysstråler gennem spredning , diffraktion , brydning og / eller refleksion . Disse forstyrrelser kan imidlertid næppe opdages under skarp feltbelysning, da lysstyrken af de afbøjede lysstråler er meget svagere end billedets stærkt oplyste baggrund. Kontrasten kan øges inden for visse grænser med lysfeltbelysning ved at vælge en mindre blænde i belysningens strålebane ( kondensatoråbning ) (se figur 2, midten). På samme tid øges imidlertid billeddannelsesfejl, og der opstår forstyrrende diffraktionsmønstre ved kanten af objekterne (sammenlign små billedsnit i figur 2).
Med transmitteret lys mørkt feltmikroskopi belyses prøven bagfra på en sådan måde, at belysningen ikke når målet direkte, men kun det lys, der afbøjes i prøven. Baggrunden for billedet ser mørk ud, mens objekter i prøven ser lys ud (se figur 1 til højre). Dette fungerer også og især med stort set gennemsigtige prøver. Selvom forskellene i lysstyrke for det afbøjede lys er svære at genkende på grund af lysfeltbilledets høje lysintensitet, ser disse forskelle meget stærkere ud i billedet af det mørke felt. De fine fedtspor på et fingeraftryk i figur 2 (højre) er derfor tydeligt synlige. De urenheder (partikler og ridser), der allerede kan ses i skarpt feltbelysning, viser en så stærk kontrast i det mørke felt, at de kun vises som lyse, overeksponerede pletter i billedet.
Med mørkt feltbelysning i transmitteret lys er det særligt vigtigt, at objektglas, dækglas og også glasoverfladerne i mikroskopet er rene, da hvert støvkorn bidrager til baggrundsstøj ved at afbøje lyset. Også lysafbøjende strukturer må ikke forekomme i forskellige planer oven på hinanden, da deres signaler ellers ville overlappe hinanden. Derfor er mørk feltbelysning ikke egnet til tykke prøver, såsom typiske vævssnit.
Fysisk set kan mørkt feltbelysning i transmitteret lys beskrives som belysning, hvor lysets hoveddiffraktionsmaksimum (se diffraktionsdisk ) ikke når linsens bageste brændplan. Kun afbøjet lys, f.eks. Sekundære maksima forårsaget af diffraktion, deltager i billedstrukturen.
Lys og mørkt felt med indfaldende lysbelysning
I lysmikroskopi bruges indfaldende lysbelysning, når lyset falder ned på prøven ovenfra (mere præcist: fra linsens side). Belysningen foregår enten gennem selve linsen eller ved en uafhængig belysningsindretning, der er anbragt til siden eller omkring linsen. Den vinkel, hvormed lyset falder på objektet, bestemmer billedets udseende. Hvis en stor del af lyset, der reflekteres af prøven, fanges af målet, fremstår objektet lyst i billedet (lysfeltbelysning). Men hvis belysningen er så langt fra siden, at det retningsreflekterede lys skinner forbi linsen, betegnes det som mørk feltbelysning.
Ved undersøgelse af materialer er brightfield -belysning den mest anvendte teknik til belysning af ru, mindre reflekterende objekter. Den indfaldende lysfeltbelysning svarer til den normale måde at se mennesker på: Glatte, meget reflekterende overflader fremstår lyse på grund af deres stærke glans (figur 3 til venstre). Refleksionen giver metaloverflader deres typiske glans. Strukturer anbragt under glas eller andre transparente overflader ville være vanskelige at se med denne type belysning på grund af den stærke refleksion på overfladen.
Med mørkt feltbelysning med reflekteret lys fremstår glatte, stærkt reflekterende overflader mørke. Kanter og overfladefejl såsom ridser eller aflejringer lyser dog kraftigt (figur 3 til højre). Disse understreges og kan lettere eller lettere genkendes med billedbehandlingsmetoder . I tilfælde af ru, mindre reflekterende overflader sørger den laterale opstilling af det reflekterede mørke feltbelysning for lokal skyggedannelse, så overfladestrukturer fremstår noget mere tredimensionelle. Denne effekt kan forbedres betydeligt af ensidig belysning.
Mørkt feltmikroskopi uden for lysmikroskopi
Udtrykkene mørkt felt og lyst felt kan også være mikroskopisk metodeoverførsel til billeddannelse uden lys, men andre signaler. Der foretages en tilsvarende forskel på, om det ikke -afbøjede excitationssignal registreres af detektoren (lyst felt), eller om kun det signal, der ændres af prøven, bidrager til billeddannelsen (mørkt felt). Processer kaldet mørke felter findes f.eks. I elektronmikroskopi (se f.eks. Scanning af transmissionselektronmikroskop ) og i akustisk mikroskopi .
Mørk feltbelysning i nutidens transmitterede lysmikroskoper
Den nemmeste måde at skabe mørk feltbelysning med et normalt transmitteret lysmikroskop med lyskilde, kondensator og linse under Koehler -belysning er at lukke kondensatoråbningen tæt og derefter flytte den sidelæns, indtil der ikke trænger mere direkte lys ind i linsen. Belysningen er derfor kun fra den ene side. Imidlertid giver især nyere mikroskoper ofte ikke mulighed for at flytte membranen i forhold til kondensatoren.
Fælles fundamenter
Bedre billedkvalitet kan opnås med en centreret kondensator ved hjælp af en ekstra enhed. Denne ekstra enhed begrænser belysningen af prøven til en konuskuvert (gul i diagrammet til højre). Den indre del af keglen indeholder ikke noget lys (grå i den skematiske tegning). Overfladen af keglen, der kommer fra kondensatoren, er fokuseret ind i prøveplanet og i det enkleste tilfælde udvides derefter igen, så upåvirket lys fuldstændig omgår den objektive åbning, billedbaggrunden forbliver mørk. Kun lys, der afbøjes af de objekter, der skal observeres, kommer ind i linsen og skaber et billede med lysstrukturer på en mørk baggrund. Alle nutidens transmitterede lys mørke feltbelysning genererer en konisk overflade, men passerer ikke altid gennem hele forberedelsen: I nogle tilfælde kommer det til den totale refleksion af det ikke-afbøjede lys på glasdækslet.
To forskellige metoder bruges til at oprette konvolut med belysningskegle. En central membran til fremstilling af keglekappen er let at fremstille og bruge, billig og derfor udbredt. Denne metode er særlig velegnet til linser med en relativt lav forstørrelse, idet tykkelsen af belysningskeglens kappe kan tilpasses optimalt til den linse, der bruges ved blot at ændre membranen. Særlige mørke feltkondensatorer opnår et højere lysudbytte gennem spejlteknologi og kan også opfylde kravene til større forstørrelseslinser ved nedsænkning . Billedkvaliteten bliver bedre.
Hvis belysningskeglekappen passerer gennem prøven som på den skematiske tegning, skal den passere linsen på ydersiden. Mørk feltbelysning er kun mulig, hvis lysets vinkel, der kommer fra kondensatoren ( åbningsvinklen ) er større end vinklen på det lys, der fanges af linsen. Jo større åbningsvinkel et objekt eller kondensator har, desto bedre er den maksimalt opnåelige opløsning . I stedet for åbningsvinklen er den numeriske blænde angivet for mål og kondensatorer , som kan være op til 0,95 uden nedsænkning og op til omkring 1,4 med olie -nedsænkning. Ved mørk feltbelysning skal kondensatorens numeriske blænde være højere end for det anvendte mål. Uden nedsænkning af kondensatoren er applikationen derfor begrænset til mål med en numerisk blænde på ca. 0,75 eller mindre. 40x objekter, der bruges uden nedsænkning, har ofte en numerisk blænde på 0,65.
Belysning med central skærm
Her bruges en ringformet membran i et ellers normalt transmitteret lysfeltmikroskop. Denne centrale membran (1 i den øverste skematiske tegning til højre) har en gennemskinnelig kant eller ring og reducerer dermed belysningen ved hjælp af en normal kondensator (2) til en keglekappe (3). For at udnytte kondensatorens åbningsvinkel optimalt bruges en del af kondensatoren, der er så langt ude som muligt. Jo større linsens åbningsvinkel er, desto større skal diameteren af det centrale uigennemsigtige område være, og belysningsstyrken reduceres tilsvarende. Startende fra prøvebordet med prøveglas (4), passerer lyset således målet (6). Kun lys (5) afbøjet af strukturer i prøven når målet. Den centrale membran kan indsættes under kondensatorlinsen i et normalt transmitteret lysmikroskop.
Den mere udbredte fasekontrastmikroskopi er baseret på et helt andet optisk fænomen, men der bruges også membraner der. Disse ringmembraner kan undertiden bruges til andre formål som mørke markmembraner. Fasekontrastringmembraner er designet på en sådan måde, at lyskeglen kommer ind i linsen, når den er korrekt justeret og ikke går forbi den, som det er nødvendigt for mørke felter. Derfor kan kun de fasekontrastringmembraner for et givet mål bruges som mørkefeltmembraner, der faktisk er beregnet til mål med en betydeligt større åbningsvinkel (højere numerisk blænde). For eksempel er en fasekontrastringmembran for et 100x olie -nedsænkningsmål generelt egnet som en mørk feltmembran til 10x og 20x tørre objekter, da olie -nedsænkningsmål har en større blændevinkel.
Mørke feltkondensatorer
Hvis kravene til billedkvaliteten er særlig høje, bruges specielle mørke feltkondensatorer i stedet for centrale åbninger. Der er tørre mørke feltkondensatorer og nedsænkning af mørke feltkondensatorer , i sidstnævnte tilfælde placeres nedsænkningsolie eller vand mellem kondensatoren og objektglasset. Dette muliggør en højere numerisk blænde og dermed en højere opløsning. En nedsænkningskondensator giver også en bedre kontrast, da refleksioner på undersiden af objektglasset og overfladen af kondensatoren, hvilket fører til en lysning af billedbaggrunden, undgås. Det er dog mere komplekst at håndtere, også fordi olie kræver omhyggeligt rengøringsarbejde. Ulempen ved begge typer af mørke feltkondensatorer i forhold til en central membran er den mere komplekse ændring til lys feltbelysning, da kondensatoren skal udskiftes til dette. Tørre mørke feltkondensatorer er velegnede til mål med numeriske åbninger op til 0,65 eller 0,75, mens nedsænkningskondensatorer kan bruges til mål med numeriske åbninger op til 1,2.
Moderne kondensatorer i mørke felter er for det meste kardioidkondensatorer. Her leder et konveks buet centralt spejl det indfaldende lys udad på et konkavt spejl, der løber rundt om det , så kegleoverfladen skabes (se sammenlignelig tegning fra 1910 til højre). Det konkave spejl har ideelt set en overflade formet som et kardioid , deraf navnet. Af fremstillingshensyn er denne overflade imidlertid designet som en kugleformet overflade, uden at dette fører til et betydeligt tab af kvalitet. En paraboloid kondensator har derimod form som et afskåret paraboloid . Lyset afbøjes kun én gang her, nemlig ved total refleksion (se tegning af Wenhams glasparaboloid nedenfor), hvilket igen skaber en allround belysningskegle.
For at sikre, at objektets numeriske blænde er mindre end kondensatorens, kan der også bruges et objektiv, hvor den numeriske blænde kan begrænses via en bevægelig iris -membran. Linsens åbningsvinkel kan således tilpasses optimalt til belysningskeglens diameter for lige at kunne skjule sidstnævnte.
Kardioid- og paraboloidkondensatorer er også kendt som catoptric darkfield- kondensatorer, fordi lyset i dem afbøjes af refleksion, mens det i de såkaldte dioptriske kondensatorer gøres af glaslinser.
Overført lys mørkt felt i stereomikroskoper
Transmitterede lyse mørke feltbelysninger er også tilgængelige for stereomikroskoper . Belysningsenheden er anbragt i stativfoden. Bortset fra selve lyskilden, f.eks. B. en halogenlampe , et centralt dæksel og ydre, opretstående reflekterende overflader bruges til at belyse objektet med en keglekonvolut. Princippet svarer nogenlunde til spejlkondensatoren beskrevet ovenfor. Objektet placeres på en glasplade, der lukker stativfoden øverst. Billedet består af lysstråler, der er blevet afbøjet i objektet ved refleksion , lysbrydning eller diffraktion . Typisk kan det centrale dæksel udskiftes med et slebet glas, således at der ud over mørke felter også er lysfelt transmitteret lysbelysning. Spejlene på ydersiden retter derefter lige så meget lys i en vinkel mod prøven som før, men på grund af den meget lysere lysfeltbelysning fører dette ikke længere til synlige effekter.
Tidligere tilgange til transmitteret lys mørke feltobservationer
Før 1900
Allerede i 1600 -tallet blev mørk feltmikroskopi brugt af Antoni van Leeuwenhoek , Robert Hooke og Christiaan Huygens til at observere blodkomponenter eller små organismer. Dog blev der ikke brugt noget særligt udstyr. Lyskilden, som f.eks. Et stearinlys, var snarere placeret, så der ikke faldt direkte lys på linsen.
Mørkt feltmikroskopi er muligt selv med et meget skråt belysende spejl. Den første til at beskrive et specielt apparat til mørk feltbelysning var Joseph Bancroft Reade (1801–1870) i 1837 , hvis metode blev omtalt i John Quecketts "Praktisk afhandling om brug af mikroskopet" i 1852 som baggrundsbelysning . Lyskilden blev placeret på siden, en konvergerende linse fokuserede lyset på prøven på en sådan måde, at upåvirket lys blev ledt forbi målet. I løbet af 1800 -tallet udviklede en række forfattere yderligere belysningsudstyr. Da brydning på glasoverflader forårsager kromatisk aberration , hvilket er særlig forstyrrende i mørke feltmikroskopi, er der også udviklet spejlkondensatorer, da denne fejl ikke opstår ved refleksion . Refleksionen blev opnået enten ved reflekterende overflader eller ved total refleksion .
Francis Herbert Wenham (1824–1908) beskrev forskellige principper for mørkt feltbelysning i flere værker mellem 1852 og 1856. Ud over sidebelysning (med en effekt svarende til Reade) inkluderede den også kondensatorer til en centralt placeret lyskilde, herunder en hul, forsølvet paraboloid og en massiv glasparaboloid, hvor refleksionen skete gennem total refleksion ( se illustration). Sliden var i direkte kontakt med kondensatoren. Præparatet var indlejret i canadisk balsam eller væske. Der var luft mellem dækslet og linsen. Princippet om diffraktion , som er afgørende for effektiv mørke feltbelysning af små genstande, blev endnu ikke forstået på det tidspunkt. Wenham antog derfor, at de observerede virkninger skyldtes, at objektet blev belyst ovenfra, nemlig af lys, der blev reflekteret tilbage på prøven ved total refleksion fra dækglasets overkant.
Fra omkring 1900
Indtil slutningen af 1800-tallet blev mørkfeltmikroskopi brugt af amatører, men lidt på det videnskabelige område, da det ikke fungerede med mål med højere opløsning (med en høj numerisk blænde ). Gennem Ernst Abbes arbejde i slutningen af 1800 -tallet blev de optiske fundamentals såsom diffraktion forstået. W. Gebhardt i Zeiss udnyttede dette ved at foreslå en central skærm til Abbes belysningsapparat til mørk feltbelysning, som Zeiss tilføjede til sit sortiment i 1898. Hvis der blev brugt nedsænkning mellem kondensatoren og objektglasset, kunne tørre objekter med en blænde på op til 0,95 bruges. Til tider blev dette centralpanel leveret med alle tilsvarende enheder, men da det ikke blev modtaget særlig godt af kunderne, blev det afbrudt. Det wienske mikroskopfirma Reichert tilbød en lignende løsning.
Med opdagelsen af syfilispatogen oplevede mørkfeltmikroskopi et opsving fra 1906, da det muliggjorde en god repræsentation af levende spirocheter , som patogenet tilhører. Flere store mikroskopvirksomheder udviklede forbedrede kondensatorer til mørke felter. At af Karl Reichert indeholdt en central åbning med en variabel størrelse. Henry Siedentopf udviklede en paraboloid kondensator til Zeiss i 1907 . Selvom designet svarede til Wenham -glasparaboloidet med en mørkning i midten af den nederste side af paraboloidet, kunne den optiske kvalitet øges gennem forbedrede fremstillingsteknikker, så den indre og ydre åbning af belysningskeglens kappe var 1,1 og 1,4. Baseret på Abbes arbejde var det klart, at diffraktion spiller en afgørende rolle for billedets tilblivelse, og at total refleksion på dækglas kun hjælper med at undgå indtrængen af upåvirket lys i linsen. I en senere version, den såkaldte lys - mørke feltkondensator , kunne den centrale mørklægning fjernes ved hjælp af en håndtag, så en hurtig ændring mellem mørkt og lys felt var mulig.
De hidtil beskrevne tilgange er baseret på det faktum, at prøven er belyst med en højere numerisk blænde, det vil sige med en bredere vinkel, end der kan registreres af målet. Men den modsatte tilgang er også mulig: Prøven belyses med en komplet kegle med en lille numerisk blænde (f.eks. 0,2). Højopløselige mål kan også bruges her, fordi den numeriske blænde og dermed åbningsvinklen kan være af enhver størrelse, men de skal være betydeligt større end belysningen. Det lys, der ikke afbøjes i prøven, vil derefter kun optage et centralt område i målet, mens det ydre område forbliver frit for direkte belysende lys. Det upåvirkede lys fjernes kvasi efterfølgende i eller bag linsen på et passende punkt i strålebanen. Dette blev omtalt som "konaksialt arrangement" eller "centralt mørkt felt" og regnes blandt de ultramikroskopiske metoder (se nedenfor). Ulempen ved denne fremgangsmåde er, at der opnås betydeligt højere lysintensiteter i prøven end for eksempel med en central membran i kondensatoren, hvilket resulterer i forstyrrende sekundære diffraktionsbilleder i prøver med mange objekter.
For et system, han udviklede, brugte Henry Siedentopf et objektiv, hvor den ellers halvkugleformede bagside af frontlinsen (det første glaslegeme i linsen) blev malet fladt og malet sort. Carl Metz (1861–1941) i Leitz udviklede et system med olie -nedsænkningsmål i 1905, hvor en stemplemembran (også: tragtdiafragma) blev bevægeligt indsat i linsen bagfra. Dette gjorde det muligt at bruge det samme objektiv uden denne membran til Brightfield -applikationer uden tab af lysstyrke. Justering var vanskelig for det.
Wladimir Sergejewitsch Ignatowski udviklede en mørk feltkondensator til Leitz, som havde to reflekterende overflader, men var lettere at håndtere end tidligere tilsvarende modeller (se diagram fra 1910 ovenfor). Den blev solgt fra 1907. Tværsnittet af efterfølgermodellen udviklet af Felix Jentzsch fra 1910 blev skabelonen til et Leitz- logo , den såkaldte Leitz-kiste.
Henry Siedentopf hos Zeiss designet også en kondensator med to reflekterende overflader, der lignede meget kondensatoren udviklet af Ignatowski. Af teoretiske årsager bør den anden reflekterende overflade svare til et afsnit af et kardioid . Kardioide overflader var vanskelige at fremstille. I stedet blev der brugt en sfærisk overflade, som gav den samme effekt inden for fremstillingstolerancerne. Ikke desto mindre blev enheden markedsført af Zeiss som en kardioidkondensator .
En oversigt over fordele og ulemper ved transmitteret lys mørkt feltbelysning
Fordele:
- Små, endda ufarvede objekter kan observeres med stærk kontrast, især godt i lave koncentrationer med tynde prøver.
- Objekter under opløsningsgrænsen forårsager også signaler, hvis belysningen er stærk nok.
- Nogle former for mørk feltbelysning, især ved lav forstørrelse, kan implementeres meget let og uden betydelige omkostninger.
- I modsætning til lys markbelysning er der ingen entoptiske fænomener med mørk feltbelysning, striber, der opstår i selve øjet og kaster skygger på nethinden.
Ulempe:
- Overflader af objekter forårsager signaler på grund af ændringen i brydningsindeks, men ikke et homogent indre, så kun grænsen derefter kan ses på billedet.
- Teknikken er ikke særlig velegnet til tykke eksemplarer eller eksemplarer med mange objekter, da for mange signaler, for eksempel fra forskellige fokusniveauer, modvirker den mørke felteffekt.
- Urenheder i strålebanen fører også til forstyrrende signaler, hvorfor kravene til rengøring af enheden og forberedelse er meget høje.
- Specielle kondensatorer er påkrævet for højere krav, da refleksionerne mellem de forskellige linser i normale kondensatorer reducerer den mørke felteffekt.
- Da åbningsvinklen for enten kondensatoren eller objektivet skal reduceres, reduceres opløsningen i forhold til lysfelt og andre kontrastforstærkende metoder såsom fasekontrast og differential interferenskontrast
Rheinberg belysning
Rheinberg -belysningen (også: optisk farve eller kontrastfarvebelysning) er en modifikation af det mørke feltmikroskopi med en central blænde, som først blev beskrevet i 1896 i London af Julius Rheinberg . Den centrale skærm erstattes af et rundt filter med to farver i et koncentrisk arrangement: En farve danner en ydre ring, den svarer til ringen i den konventionelle ringskærm. Det lys, der passerer her, falder kun ned i linsen, hvis det afbøjes i prøven. Den anden farve er i midten, ellers uigennemsigtig område. Det definerer baggrunden for billedet. På denne måde skabes æstetisk meget tiltalende billeder, uden at yderligere strukturer bliver synlige.
Under navnet Mikropolychromar leverede Zeiss kondensatortilbehør omkring 1939 indtil efter Anden Verdenskrig, hvormed Rheinberg -belysning var mulig. Et centralt lyst felt og en ydre mørk feltbelysning kunne farves anderledes med filtre. Zeiss anbefalede denne enhed "for at lette undersøgelsen af ufarvede objekter med lave kontraster". Gerlach (2009) skrev om denne facilitet, at den "bestemt havde en vis betydning før indførelsen af fasekontrastmetoden". Reichert -virksomheden solgte en spejlkondensatorbaseret løsning under navnet Optikolor , hvilket også gjorde Rheinberg -belysning mulig.
Med trefarvede Rheinberg-filtre kan præparater, der er klart strukturerede, vises særligt effektivt. Filterets ydre ring er opdelt i fire 90 ° vinkler, de modsatte kvadranter er farvet på samme måde, men nabokvadranter er farvet forskelligt. Den indre cirkel er farvet med den tredje farve. Den tofarvede ydre ring betyder, at strukturer, der spredes fra venstre mod højre, vises i en anden farve end dem, der spredes fra forsiden til bagsiden i prøveplanet. Eksempler på sådanne præparater er kiselalger eller tekstilstoffer .
Mørk feltbelysning i reflekterede lysmikroskoper
Klassisk reflekteret lys mørkt feltmikroskopi
Med reflekteret lysmikroskopi udstråles lyset fra den samme side, hvorfra det observeres. Denne procedure bruges til uigennemsigtige materialer, f.eks. Mineraler eller materialetest . Med indfaldende lys, klart feltbelysning, kan belysningen indføres via den samme objektive strålebane, der også bruges til observation.
I tilfælde af reflektion af mørkt feltbelysning er belysnings- og observationsstrålebanerne imidlertid adskilt: Speciallinser har et ekstra ydre område, der er forbeholdt belysningsstrålestien (se diagram). Det indre område svarer til en normal linse, med mørk feltbelysning bruges den udelukkende til observation. Det ydre område svarer til kondensatoren. Her ledes lyset (1 på tegningen) skråt ind på prøven (4) gennem et ringformet, konkavt spejl i det ydre område (3). Hvis prøven var et fladt spejl, ville det reflekterede lys der fuldstændig omgå linsens indre område: billedet ville forblive mørkt. Lys der afbøjes af overfladestrukturer, såsom ridser, optages derimod af linsen (5).
Med nogle reflekterede lys mørke feltlinser er det muligt at vise eller skjule individuelle sektorer af belysningsringen. Dette kan intensivere dannelsen af skygger, så strukturer, der løber i bestemte retninger, bedre kan genkendes. Med såkaldte Ultropak-belysningsenheder kan 'kondensatoren', der er knyttet til målet, justeres i højden for at belyse forskellige niveauer i prøven så meget som muligt. Ved lave forstørrelser kan den nødvendige lysintensitet også opnås ved hjælp af en ekstern lyskilde, der er opsat på siden, f.eks. Fiberoptiske lys.
Overfladestrukturer som ridser skiller sig tydeligt ud fra baggrunden i det reflekterede lys mørke felt, da lys reflekteret eller spredt på dem delvist ledes ind i linsens centrale område. Sådanne strukturer er derfor lyse på en mørk baggrund i billedet. Følgelig er belysning af mørkt felt med reflekteret lys særligt velegnet til undersøgelse af overflader, for eksempel inden for materialevidenskab . Mørk feltbelysning er udbredt i reflekterede lysmikroskoper. I modsætning til transmitteret lys mørkt feltbelysning kan reflekteret lys mørkt feltbelysning også bruges med de mest kraftfulde linser. For at undgå uønskede refleksioner skal du arbejde uden dækglas, hvis det er muligt.
Reflekteret lys mørkt felt i stereomikroskoper
Med stereomikroskoper kan mørkt felt med reflekteret lys implementeres ved, at belysningen har en tendens til at græsse overfladen, og det retningsbestemte reflekterede lys ikke når målet direkte. Dette er f.eks. Muligt ved let at vippe en flad prøve eller ved smart at placere frit placerede lyskilder (f.eks. Svanehalsbelysning med en lang, fleksibel holder). Til ringformet, allround mørk feltbelysning er der for eksempel specielle ringlys med en strålevinkel på 60 °, som er anbragt i en lille afstand på kun 5–15 mm over prøven. Den tilhørende mørke feltadapter (højdejusterbar rør) tillader montering på objektivet og undgår spredt lysstråling. Et eksempel på en prøve, der er registreret med en sådan belysning, er billedet af den rigtige 2 euro -mønt i ovenstående sektion lyst og mørkt felt med indfaldende lysbelysning . I stereomikroskoper ses reflekteret lys mørkt feltbelysning undertiden som standardtype belysning.
I tilfælde af mindre reflekterende objekter skaber det mørke feltbillede en mere eller mindre tredimensionel repræsentation afhængigt af indfaldsvinklen. Ekstreme mørke feltforhold kan opnås med linjelys, der skaber et lysbånd, der fejer henover overfladen fra den ene side i en ekstremt flad belysningsvinkel. Dannelsen af skygger resulterer i billeder med meget høj kontrast, selv af små højdeforskelle. Fingeraftryk kan let vises på flade, jævne overflader.
Sidestream Dark Field Imaging
Sidestream dark field imaging (forkortet SDF, på tysk: Sidestream dark field imaging) er en metode til undersøgelse af mikrocirkulation , dvs. til undersøgelse af små og meget små blodkar . Proceduren udføres med en lille enhed, hvormed sådanne kar kan undersøges hos patienter, for eksempel under tungen, hvor der ikke er forstyrrende hudlag. Teknikken anvender en central lysstyring , hvor en linse projicerer billedet af prøven på en kamerachip. Lyset fra grønne lysemitterende dioder ( bølgelængde 530 nm) udstråles på prøven fra en ring omkring den centrale lysleder .
Spredningen i prøven resulterer i en jævn fordeling af lyset i det observerede område, så der skabes en slags baggrundsbelysning. Den hæmoglobin i de røde blodlegemer absorberer grønt lys meget kraftigt, således at blodkarrene, som tæt fyldt med røde blodlegemer, skiller sig ud som mørke strukturer mod en lys baggrund. Den maksimale indtrængningsdybde i vævet er 500 mikrometer.
Påvisning af submikroskopiske partikler
Optisk grundlæggende
Ved mørkt feltmikroskopi afhænger signalets styrke ikke af en strukturs størrelse, men af hvor stærkt lyset afbøjes af det. Derfor kan den, ligesom fluorescensmikroskopi , også bruges til at detektere nogle partikler eller strukturer, der er mindre end opløsningsgrænsen for det respektive mikroskop. I dette tilfælde er det imidlertid ikke muligt at skelne mellem, om signalet kommer fra kun en eller fra flere strukturer, der er tæt på hinanden. Der er heller ikke noget billede, men et diffraktionsfænomen kendt som en punktspredningsfunktion , hvis størrelse igen afhænger af mikroskopets opløsning.
Partiklernes form (rund, aflang, kantet ...) er uden betydning for formen og størrelsen af det genererede diffraktionsfænomen, så partiklernes form ikke kan bestemmes. For mindre partikler falder intensiteten imidlertid, fordi der afbøjes mindre lys på dem. Derfor kræves der stærk belysning for dem. Intensiteten er også afhængig af forskellen i den optiske densitet ( brydningsindeks ) mellem strukturen og det omgivende medium, da mere lys afbøjes med større brydningsindeksforskelle.
Eksempler
Mørk feltbelysning bruges i Millikan -eksperimentet , hvor mørkefeltteknikken muliggør observation af oliedråber i en kondensator . Robert Andrews Millikan modtog Nobelprisen i fysik i 1923 for at bestemme elementærladningen for en elektron ved hjælp af dette eksperiment .
Mørkt feltmikroskopi kan også bruges til at detektere metalpartikler i vævsafsnit (se også figur).
Ultramikroskopi
Omkring 1900 blev udtrykket "ultramikroskopi" brugt til at beskrive den mørke feltmikroskopiske undersøgelse af såkaldte "ultramikroner", partikler mindre end lysets opløsningsgrænse, dvs. mindre end 0,2 mikrometer . Minimumsstørrelsen af sådanne partikler, som blev bestemt allerede i 1902 med stærkt sollys i rubinglas af guld ved hjælp af et ultramikroskop, er mindre end fire nanometer .
Den slids ultralyd mikroskop udviklet af Henry Siedentopf og Richard Zsigmondy blev anvendt til at undersøge kolloider , det var ikke egnet til biomedicinske undersøgelser. Belysningen fandt sted i form af et plan, som blev koblet ind i siden af prøven, svarende til den mere moderne teknologi af lys disk mikroskopi (SPIM), hvor lasere anvendes, og fluorescens kan også exciteres. For at skabe flyet blev der anbragt et hul foran kilden til belysning med ultramikroskopet, hvis kanter kun var nogle få hundrededele af en millimeter fra hinanden. Denne kløft blev reduceret med ca. 50 gange ved hjælp af et linsesystem og endelig afbildet i prøven. Den Zeiss Virksomheden tilbød slids ultralyd mikroskoper, herunder tilbehør i 1910 til 474.50 point (for kolloider i væsker) eller 744.50 mærker (kolloider i solide materialer). For at kunne observere nanopartikler i især væsker og studere deres adfærd, udviklede Richard Zsigmondy yderligere det ultralydsmikroskop i Göttingen sammen med R. Winkel GmbH og præsenterede i 1912 nedsænkningens ultralydsmikroskop.
En helt anden belysningsgeometri blev brugt i det forenklede ultramikroskop udviklet af Cotton og Mouton i 1903. En lyskegle blev ført ind i et glasprisme med parallellogramsideflader . Der blev skabt total refleksion på undersiden af glaslegemet , som førte lyset til prøven. Den objektglas blev placeret direkte på glaslegemet med nedsænkning. Lysstrålerne ramt prøven på en sådan vinkel, totalrefleksion også blev forårsaget på den øvre kant af dækglasset og ingen direkte lys ramt målet. Kun lys, der var diffrakteret i prøven, blev registreret. Denne opsætning kunne ikke bruges med nedsænkningsmål, da der ellers ikke ville være nogen total refleksion på dækglaset.
Andre anvendelser
Spirochaetes af arten Borrelia burgdorferi , optaget med mørk feltbelysning. Skalaen svarer til 8 µm til venstre og 25 µm til højre.
|
Zebrafiskembryoner under belysning af mørkt felt. Begge blev varmebehandlet. I venstre embryo med en ændring i et specifikt gen , forbliver vækstskader i afgrænsningen af kropssegmenterne (over pilespidsen), hvilket kan bestemmes af fraværet af afgrænsningen under mørk feltbelysning, til højre et normalt embryo for sammenligning.
|
På grund af den begrænsede opløsning af mørke feltmikroskopi sammenlignet med andre kontrastforbedringsmetoder, såsom fasekontrast eller differential interferenskontrast , er det kun af betydning for nogle få specielle anvendelser inden for biologi og medicin i dag . (Se billeder til højre for eksempler fra forskningsarbejde fra 2007 og 2008.) For eksempel bruges det stadig til mikroskopisk påvisning af nogle patogener i klinisk mikrobiologi , såsom spirochaeter . Evnen til at detektere submikroskopiske strukturer kan bruges til at studere isolerede organeller og polymerer såsom flagella , cilia , mikrotubuli og aktinfilamenter .
I halvlederindustrien bruges reflekteret lys mørkt feltmikroskopi til at inspicere overfladen af wafers for at finde snavspartikler. Sådanne undersøgelser udføres med tørre mål (dvs. uden nedsænkning ); opløsningsgrænsen her er omkring 0,35 mikrometer . Takket være mørk feltbelysning er der imidlertid også synlige partikler, der falder under denne grænse.
I metallografi udføres de fleste mikrosektionsundersøgelser i brightfield. Derudover kan darkfield med fordel bruges til at visualisere mekaniske overfladedefekter (ridser, revner, indeslutninger, porer , hulrum eller udbrud) og til at undersøge korngrænser på ætsede sektioner . Farverne på inklusioner ( sulfider eller oxider ) vises mere tydeligt i det mørke felt end i det lyse felt, så tildelinger er lettere.
På grund af de æstetisk tiltalende billeder er mørkfeltmikroskopi blevet mere udbredt blandt amatørmikroskopister. Med det kan for eksempel gennemsigtige vandmikroorganismer ( plankton ) observeres (se de første billeder af artiklen og weblinks ).
Alternativ medicin
Anvendelsen af mørk feltmikroskopi i alternativ medicin som diagnostisk metode til blodprøver har til formål at påvise et stort antal sygdomme. Ofte efterfølges dette af salg af kosttilskud og andre lægemidler til behandling af påståede diagnosticerede sygdomme. Den diagnostiske teknik er baseret på den antagelse, at visse sygdomme forårsager synlige fænomener af frisk blod (for eksempel erythrocytaggregation). Metoden er hverken plausibel eller pålidelig diagnostisk metode; der stilles falske positive eller negative diagnoser.
Ifølge Günther Enderlein ( isopati ) bør mørkt feltmikroskopi muliggøre tidlig kræftopdagelse. Processen er baseret på videnskabeligt uholdbare antagelser om mikroorganismernes morfologi (såkaldt pleomorfisme ). En videnskabelig undersøgelse i 2005 konkluderede, at mørkfeltmikroskopi var uegnet til at opdage kræft.
En anden alternativ medicinsk blodprøve, der udføres ved hjælp af mørkt feltmikroskopi, er von Brehmer mørke feltblodtest . Dette går tilbage til apotekeren Wilhelm von Brehmer og er også beregnet til at muliggøre tidlig opdagelse af kræft. Der er imidlertid intet bevis på egnethed. This blodprøve ser for Propionibacterium acnes (alias Siphonospora s. ), Hvilket er en typisk bestanddel af hudflora og kan let forurene smear som en del af blodprøven.
Weblinks
- Michael Volger (red.: Irene K. Lichtscheidl): Mørkt felt. Hentet den 17. juni 2012 (Teoretisk introduktion og instruktioner til praktisk anvendelse ved universitetet i Wien. Findes også som PDF .).
- Christian Linkenheld: Mørk feltmikroskopi med den centrale blænde metode og mørke felt mikroskopi med specielle mørke felt kondensatorer . 2002, adgang 14. maj 2012.
- Paraboloiden kondensator og cardioid kondensator fra Zeiss i Museum of Optiske instrumenter .
- Mørk feltbelysning i materialevidenskab, en oversigt over belysningsteknologier ved University of Siegen .
- Nedsænkning ultralydsmikroskop ifølge R. Zsigmondy med optik patenteret i 1912
Individuelle beviser
- ↑ a b c d e f D. Gerlach: lysmikroskopi . S. 13-85 . I: Horst Robenek (red.): Mikroskopi i forskning og praksis . GIT-Verlag, Darmstadt 1995, ISBN 3-928865-18-8 , s. 48, 65 .
- ↑ a b c d A. Ehringhaus: Mikroskopet dets videnskabelige grundlag og dets anvendelse . 2. udgave. Forlag B. G. Teubner, Leipzig og Berlin 1938, s. 95-109 .
- ^ Sophie Perrot: Belysning er alfa og omega! Valg af passende belysning til applikationer i industriel billedbehandling . I: Optik og fotonik . tape 3 . Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 2010, s. 51-55 ( wiley-vch.de [PDF]).
- ↑ Oleg Kolosov og Kazushi Yamanaka: Justerbar akustisk knivkant til anisotrop og akustisk billedbehandling i mørke felter . I: Jpn. J. Appl. Fys. tape 33 , 1994, s. 329-333 , doi : 10.1143 / JJAP.33.329 .
- ↑ a b c d e f g h i Randy O. Wayne: Lys- og videomikroskopi . Academic Press, Elesevier, 2009, ISBN 978-0-12-374234-6 , s. 95-98 .
- ↑ a b c d e f g h Dieter Gerlach: Lysmikroskopet. En introduktion til funktion, håndtering og særlige procedurer for læger og biologer . Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1976, ISBN 3-13-530301-2 , s. 119-126 .
- ↑ a b Horst Riesenberg: Optisk system af mikroskopet i: Hermann Beyer, Horst Riesenberg (Hrsg.): Handbuch der Mikoskopie . 3. Udgave. VEB Verlag Technik, Berlin 1988, ISBN 3-341-00283-9 , s. 24-107 . Side 107
- ^ En b Savile Bradbury, Peter Evennett: Kontrast teknikker i lysmikroskopi . Udg .: Royal Microscopical Society, Microscopy Handbooks. BIOS Scientific Publishers Limited, 1996, ISBN 1-85996-085-5 , s. 32-33 .
- ^ Heinz Appelt: Introduktion til mikroskopiske undersøgelsesmetoder . 4. udgave. Akademisk forlagsfirma Geest & Portig KG, Leipzig 1959, s. 106 f .
- ^ Websted Nikon Microscopy U, Stereomicroscopy: Darkfield -belysning .
- ↑ JB Reade: En ny metode til belysning af mikroskopiske objekter . I: CR Goring, Andrew Pritchard (red.): Micrographia: indeholdende praktiske essays om reflekterende, sol-, oxy-hydrogengasmikroskoper; mikrometer; øjenstykker osv. & c . 1837, tillæg 2, s. 227–231 ( begrænset eksempel i Google Bogsøgning).
- ^ John Thomas Queckett: En praktisk afhandling om brugen af mikroskopet . 2. udgave. H. Bailliere Publisher, London 1852, s. 194 ( begrænset eksempel i Google Bogsøgning).
- ↑ a b c d e f g h i j k Dieter Gerlach: Historie om mikroskopi . Verlag Harri Deutsch, Frankfurt am Main 2009, ISBN 978-3-8171-1781-9 , s. 663-676 .
- ↑ a b Henry Siedentopf : Spejlkondensatorernes forhistorie . I: Journal of Scientific Microscopy . tape 24 , 1907, s. 382-395 ( online ).
- ^ FH Wenham: Om en metode til belysning af uigennemsigtige objekter under mikroskopets højeste beføjelser . I: Transaktionerne fra Microscopical Society of London . tape 4 , 1856, s. 55–60 ( begrænset eksempel i Google Bogsøgning).
- ↑ Henry Siedentopf : paraboloiden kondensator, en ny fremgangsmåde til mørkefelt belysning til visualisering og til øjeblikkelig mikrofotografi af levende bakterier mv (især for Spriochaete pallida) . I: Journal of Scientific Microscopy . tape 24 , 1907, s. 104-108 ( online ).
- ↑ Hubert de Martin, Waltraud de Martin: Fire århundreders mikroskop . Weilburg Verlag, Wiener Neustadt 1983, ISBN 3-900100-06-3 , s. 134 .
- ^ Mortimer Abramowitz, Michael W. Davidson: Rheinberg Illumination. I: Molecular Expressions - Optisk primer. Florida State University, adgang til 17. maj 2012 .
- ^ A b Rainer Wegerhoff, Olaf Weidlich, Manfred Kässens: Kontrast og mikroskopi . I: Grundlæggende om lysmikroskopi og billeddannelse. Specialudgave af Imaging & Microscopy in Collaboration with Olympus . 2. udgave. 2011, s. 22-33 ( download ).
- ^ HG Kapitza: Mikroskopi fra begyndelsen . 2. reviderede udgave. Carl Zeiss Jena GmbH, 1997, s. 32 ( download side ).
- ↑ a b Dieter Gerlach: Lysmikroskopet. En introduktion til funktion, håndtering og særlige procedurer for læger og biologer . Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1976, ISBN 3-13-530301-2 , s. 220 f .
- ↑ Brochure fra Zeiss Stemi DR, Stemi DV4, Stemi 2000 stereomikroskoper , åbnet den 8. juli 2012
- ^ Ehlert & Partner: LED -belysning til stereomikroskopi , åbnet den 8. juli 2012
- ↑ a b Brochure fra Zeiss: KL1500 LCD og KL 2500 LCD kolde lyskilder , åbnet den 8. juli 2012
- ↑ a b R. Gieseler: Stereomikroskopi . I: Horst Robenek (red.): Mikroskopi i forskning og praksis . GIT-Verlag, Darmstadt 1995, ISBN 3-928865-18-8 , s. 87-127 . S. 109
- ↑ a b P. W. Elbers, C. Ince: Mekanismer for kritisk sygdom - klassificering af abnormiteter i mikrocirkulationen i distributivt chok. I: Kritisk pleje. Bind 10, nummer 4, 2006, ISSN 1466-609X , s. 221. doi: 10.1186 / cc4969 , PMID 16879732 , PMC 1750971 (fri fuld tekst), (anmeldelse).
- ↑ a b C. M. Treu, O. Lupi, DA Bottino, E. Bouskela: Sidestream dark field imaging: udviklingen af realtids visualisering af kutan mikrocirkulation og dens potentielle anvendelse i dermatologi. I: Arkiver for dermatologisk forskning. Bind 303, nummer 2, marts 2011, ISSN 1432-069X , s. 69 ff., Doi: 10.1007 / s00403-010-1087-7 , PMID 20972572 (anmeldelse).
- ^ Robert Andrews Millikan : Isolering af en ion, en præcisionsmåling af dens afgift og korrektion af Stokes lov . I: Fysisk gennemgang (serie I) . tape 32 , nej. 4 , 1911, s. 349-397 , doi : 10.1103 / PhysRevSeriesI.32.349 .
- ↑ Påvisning af uorganiske stoffer: 8. Generel påvisning af metaller. I: Benno Romeis , Peter Böck (red.): Mikroskopisk teknologi. 17. udgave. Urban & Schwarzenberg , München / Wien / Baltimore 1989, ISBN 3-541-11227-1 , s.429 .
- ↑ H. Siedentopf, R. Zsigmondy: Om visualisering og størrelsesbestemmelse af ultramikroskopiske partikler, med særlig anvendelse på guld -rubinglas . I: Annals of Physics . tape 315 , 1902, s. 1-39 , doi : 10.1002 / andp.19023150102 .
- ↑ W. Gebhardt: For optiske og mekaniske værksteder I . I: Journal of Scientific Microscopy . tape 24 , nej. 4 , 1907, s. 396-421 ( online ).
- ↑ Timo Mappes, Norbert Jahr, Andrea Csáki, Nadine Vogler, Jürgen Popp og Wolfgang Fritzsche: Opfindelsen af Immersion ultramikroskop i 1912 - begyndelsen af nanoteknologi? . I: Angewandte Chemie . 124, nr. 45, 2012, s. 11307-11375. doi : 10.1002 / anie.201204688 .
- ^ Douglas B. Murphy: Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging . Wiley-Liss, New York 2001, ISBN 978-0-471-25391-4 , s. 112-115 .
- ↑ Jan Albers: Kontaminering i mikrostrukturen . 1. udgave. Hanser Verlag, 2005, ISBN 978-3-446-40291-1 , s. 110-113 (på Google Bøger ).
- ^ ETH Zürich, Practical IV: Metallography Light Microscopy Practical IV: Metallography Light Microscopy ( Memento fra 22. januar 2016 i internetarkivet ) (PDF; 5,5 MB), åbnet den 8. juli 2012
- ↑ Buehler: Summen af vores erfaring: En guide til udarbejdelse af materialer og deres evaluering ( Memento fra 20. januar 2013 i internetarkivet ) (PDF; 5,0 MB), åbnet den 8. juli 2012
- ^ A b Edzard Ernst : Healing or Humbug?: 150 alternative medicinske procedurer fra akupunktur til yoga . 1. udgave. Springer, Berlin 2020, ISBN 978-3-662-61708-3 , s. 80-81 , doi : 10.1007 / 978-3-662-61709-0 .
- ^ Samer El-Safadi et al.: Tillader Enderlein darkfield-mikroskopi diagnosen kræft? En potentiel undersøgelse . I: Forskning i komplementær og klassisk naturmedicin . tape 12 , 2005, s. 148-151 , doi : 10.1159 / 000085212 .